Nuôi cấy, phân lập, định danh Enterobacteriaceae (Họ trực khuẩn đường ruột)

Mục tiêu:

1. Trình bày được tiêu chuẩn chẩn đoán các vi khuẩn thuộc họ trực khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.
2. Thực hiện được các bước định danh E. coli, K. pneumoniae.
3. Chẩn đoán phân biệt được các trực khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.

1. Giới thiệu

Enterobacteriaceae (Họ trực khuẩn đường một) là một họ lớn, phức tạp. Chúng có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan như tiêu hoá, tiết niệu, hô hấp… và nhiễm khuẩn huyết. Các trực khuẩn đường ruột gây bệnh quan trọng là E. coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus…

Hiện nay đa số các trực khuẩn đường một có khả năng sinh men β – lactamase phổ mở rộng (ESBL: Extended spectrum beta-lactamase) đề kháng với nhiều loại kháng sinh, kể cả các cephalosporin thế hệ 3 làm cho việc điều trị hết sức khó khăn. Điều trị chủ yếu dựa vào kháng sinh đồ.

Enterobacteriaceae có nhiều đặc điểm chung như:

• Là các trực khuẩn.
• Bắt màu Gram (-).
• Di động (nếu di động thường có lông xung quanh thân) hoặc không di động (không có lông).
• Hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện.
• Phát triển tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường.
• Sử dụng glucose bằng hình thức lên men.
• Phân giải nitrat thành nitrit.
• Oxydase (-).

2. Hình thể và tính chất bắt màu

Enterobacteriaceae là trực khuẩn bắt màu Gram âm, hầu hết có lông, một số ít chủng có vỏ.

3. Nuôi cấy, phân lập

3.1. Môi trường

Phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường (thạch thường, thạch máu…), kể cả môi trường có mật (Mac Conkey, SS…).

3.2.  Điều kiện ủ ẩm

• Khí trường: Enterobacteriaceae thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, có thể ủ ở điều kiện khí trường thường hoặc khí trường 5% C0₂.
• Nhiệt độ: có khả năng phát triển ở 44°C và nhiệt độ tối ưu là 35-37°C
• Thời gian ủ ấm: 12-24 giờ.

3.3. Hình thái khuẩn lạc

Trên môi trường thạch máu Enterobacteriaceae thường có khuẩn lạc dạng S, đường kính 1-2 mm, sắc tố màu trắng hoặc vàng, có thể tan máu β hoặc không tan máu.

3.4. Tính chất hóa sinh chính

• Phản ứng [+]: Sử dụng glucose bằng hình thức lên men; Phân giải nitrat thành nitrit
• Phản ứng [-]: Oxidase

5. Định danh E. coli

5.1. Nhuộm Gram: Trực khuẩn, bắt màu Gram (-), đa số di động.

5.2. Hình thái khuẩn lạc:

• Trên môi trường thạch máu E. coli thường có khuẩn lạc dạng S, đường kính 2 mm, sắc tố màu trắng trong hoặc đục, có thể tan máu β hoặc không tan máu.
• Trên môi trường DCA, SS, Mac Conkey khuẩn lạc đỏ do lên men lactose.

5.3. Tính chất sinh vật học chính:

• Có tính chất chung của họ Enterobacteriaceae: Oxydase (-); Glucose (+); Khử NO3 thành N0₂.
• Phản ứng [+]: lên men manit, saccarose, lactose; Indol; RM; Sinh hơi; Di động.
• Phản ứng [-]:VP; Citrate;H₂S

5.4. Chẩn đoán phân biệt

• Shigella
• Citrobacter
• Edwarsiella tarda

6. Chẩn đoán K. pneumoniae

6.1. Nhuộm Gram

Trực khuẩn Gram (-), thường đứng thành đôi, không di động, có vỏ dày (kích thước có thể gấp 2-3 lần tế bào vi khuẩn).

6.2. Hình thái khuẩn lạc:

• Trên môi trường thạch máu K. pneumoniae thường có khuẩn lạc dạng S, nhày, mỡ, đường kính 2 mm, sắc tố màu trắng đục, có thể tan máu β hoặc không tan máu.
• Trên mồi trường DCA, SS, Mac Conkey khuẩn lạc hồng do lên men lactose.

6.3. Tính chất sinh vật học chính:

• Có tính chất chung của họ Enterobacteriaceae: Oxydase (-); Glucose (+); Khử NO₃ thành N0₂.

• Phản ứng [+]: Lên men glucose và nhiều loại đường khác, đa số các chủng lên men đường lactose; Đỏ methyl; Indol; Sinh hơi.
• Phản ứng [-]: Citrat;Urea; Di động; H₂S

Bảng 1. Tính chất hóa sinh của các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae

Loài (Species)	Lactose	Glucose	Sinh hơi	H2S	Di động	Urea	Indol	Citrat
Citrobacter freundii	(+/-)	(+)	(+)	(+)	(+)	(+/-)	(-)	(+)
Citrobacter diversus	(-)	(+)	(+)	(-)	(+)	(+/-)	(+)	(+)
Escherichia coli	(+)	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(+)	(-)
Shigella dysenteria	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+/-)	(-)
Shigella flexneri	(-)	(+)	(+/-)	(-)	(-)	(-)	(+/-)	(-)
Shigella boydii	(-)	(+)	0-/-}	(:)	(-)	(-)	(+A)	(-)
Shigella sonnei	(+/-)	ω	(-)	(:)	(-)	(-)	(-)	(-)
Salmonella paratyphi B,C	(-)	(+)	(+)	(-H-)	(+)	(-)	(-)	(+)
Salmonella paratyphi A	(·)	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
Salmonella typhi	(-)	(+)	(-)	(-0	(+)	(-)	(-)	(-)
Salmonella arizona	(+/-)	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
Klebsiella pneumoniae	(+)	(+)	(++)	(-)	(-)	(+)	(+/-)	(+)
Enterobacter aerogenes	(+)	(+)	(++)	(-)	(+)	(-)	(-)	(+)
Enterobacter cloacae	(+)	(+)	(++)	(-)	(+)	(-)	(-)	(+)
Serratia marcescens	(-)	(+)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(+)
Serratia liquefaciens	(-)	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(+)
Morganella morganii	(-)	(+)	(+/-)	(-)	(+)	(+)	(-)	(-)
Proteus mirabilis	(-)	(+)	(+)	(+)	(++)	(+)	(-)	(-)
Proteus vulgaris	(-)	(+)	(+/-)	(+)	(++)	(+)	(+)	(-)