Nuôi cấy, phân lập, định danh Pdeudomonas Aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh)

Mục tiêu

1. Trình bày được các tiêu chuẩn định danh Pseudomonas aeruginosa.
2. Thực hiện được kỹ thuật định danh Pseudomonas aeruginosa.

1.Giới thiệu

Pseudomonas aeruginosa có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan và nhiễm khuẩn bệnh viện. Pseudomonas aeruginosa thường tồn tại lâu trong môi trường bệnh viện như nước rửa, nền nhà, bàn tay nhân viên y tế.

Pseudomonas aeruginosa thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập vào máu gây nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra, chúng có thể gây viêm đường tiết niệu, viêm đường hô hấp, gây nhiễm khuẩn trong tổ chức ghép, đặc biệt sau thủ thuật can thiệp như nội soi, catheter, nội khí quản, ống dẫn lưu…

Nhiễm khuẩn do Pseudomonas aeruginosa khó điều trị do vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Nhiễm khuẩn huyết do Pseudomonas aeruginosa tỷ lệ tử vong cao.

2. Hình thể và tính chất bắt màu

Pseudomonas aeruginosa là những trực khuẩn, bắt màu Gram âm, mảnh, thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, kích thước 0,5-1,0 x 1,5-3μm, di động nhờ một lông ở một đầu, không sinh nha bào, có pili ở cực (rộng 6nm).

3. Nuôi cấy, phân lập

3.1. Môi trường

Trực khuẩn mủ xanh phát triển dễ dàng trên các môi trường thông thường như thạch thường, thạch máu, Mac Conkey.

3.2. Điều kiện ủ ấm

• Khí trường: Pseudomonas aeruginosa thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, có thể ủ ở điều kiện khí trường thường.
• Nhiệt độ: Có thể phát triển ở nhiệt độ 4°C – 41°C, nhưng thích hơp nhất là 37°C, ưa pH trung tính.
• Thời gian ủ ấm: 12-24 giờ.

3.3. Hình thái khuẩn lạc

• Trong canh thang: trực khuẩn mủ xanh mọc làm đục đều môi trường sau 24 giờ và tạo váng bề mặt sau 48 giờ.
• Trên thạch máu, thạch thường: Có thể hình thành các ba dạng khuẩn lạc.

+ Khuẩn lạc dạng S: đường kính 1-2 mm, tròn, trơn, hơi lồi sau 18-24h, có thể tan máu beta, có ánh kim, có sác tố xanh lục, có mùi thơm đặc biệt như mùi nho.

+ Khuẩn lạc dạng R: đường kính nhỏ hơn, thô ráp, lồi, thường phân lập được từ ngoại cảnh.

+ Khuẩn lạc dạng M: khuẩn lạc dạng nhầy, tan máu beta.

3.4. Tính chất sinh sắc tổ:

Trực khuẩn mủ xanh có thể tiết bốn loại sắc tố:

• Pyocyanin: là sắc tố phenazin, có màu xanh da trời, tan trong nước và tan trong clorofoc, 96% P. aeruginosa sinh sắc tố này. Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí, dễ dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường hoặc dùng môi trường King  A để phát hiện sinh sắc tố. Chỉ có P. aeruginosa sinh sắc tố pyocyanin.
• Pyoverdin (còn gọi là fluorescent): sắc tố có màu xanh lục, tan trong nước, nhưng không tan trong clorofoc. Dùng môi trường King B để phát hiện sắc tố này. Ngoài P. aeruginosa còn có các vi khuẩn khác sinh pyoverdin là P. fluorecens, P. pytida, P. veroni, p. monteilla cũng có khả năng sinh sắc tố này.
• Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh ra sắc tố này.
• Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng P. aeruginosa sinh sắc tố này.

Tuy nhiên không phải tất cả các P. aeruginosa đều sinh sắc tố, khoảng 5- 10% số chủng P. aeruginosa không sinh sắc tố.

4. Tính chất hoá sinh chính

• Oxydase (+) (trong vòng 10 giây)
• Di động (+), hiếu khí bề mặt
• Sử dụng glucose và các đường khác theo hình thức “oxy hóa”
• Không sử dụng glucose và các đường khác bằng hình thức lên men.
• Phản ứng (+): Di động (hiếu khí bề mặt), citrate cimmons, acetamid, ADH.
• Phản ứng (-): Indol, Urease (-/+), H2S, ONPG, LDC, ODC.
• Có khả năng mọc ở 42°C

5. Chẩn đoán phân biệt với P. fluorescens và P. putida

• Pyocyanin (-); Không có khả năng mọc ở mọc 42°C; Không khử N0₃ thành N0₂, N0₂ thành NO.
• Có khả năng mọc ở 4°C.