Xét nghiệm cấy dịch tỵ hầu tìm vi khuẩn gây bệnh

Mục tiêu

1. Thực hiện được các bước của kỹ thuật cấy dịch tỵ hầu tìm vi khuẩn gây bệnh.
2. Tính được số lượng vi khuẩn có trong 1ml dịch tỵ hầu sau khỉ nuôi cấy.

1. Môi trường

• Thạch máu
• Thạch Socola

2. Cấy đếm dịch tỵ hầu (theo Keizo Masumoto, Tsiyoshi Nagatake – Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University, Japan)

(1) Nhúng que tăm bông hoặc lấy 1 ăng 100 μl (tương đương 0,1 mi) dịch tỵ hầu vào ống 5 ml dung dịch NaCl 0,9% tạo ống số 1 (có độ pha loãng tương ứng 10^-2).

(2) Lấy 0,5 ml dung dịch ống số 1 cho sang ống số 2 chứa 4,5 ml NaCl 0,9% (có độ pha ỉoãng tương đương 10^–3).

(3) Lấy 0,5 ml dung dịch ống số 2 cho sang ống số 3 chứa 4,5 ml NaCl 0,9% (có độ pha loãng tương đương 10^–4).

(4) Lấy 0,5 ml dung dịch ống số 3 cho sang ống sổ 4 chứa 4,5 ml NaCl 0,9% (có độ pha loãng tương đương 10^–5).

(5) Lấy 0,5 ml dung dịch ống số 4 cho sang ống số 5 chứa 4,5 ml NaCl 0,9% (có độ pha loãng tương đương 10^–6).

(6) Lấy 0,5 roi dung dịch ống số 5 cho sang ống số 6 chứa 4,5 mi NaCl 0,9% (có độ pha loãng tương đương 10^–7). Chú ý: Chỉ ống số 1 chứa 5 ml, từ ống số 2-6 đều chứa 4,5 ml dung dịch NaCl 0,9%.

(7) Dùng que cấy 10 μl cấy các hỗn dịch đã pha loãng ở trên theo thứ tự từ ống số 6 đến ống số 1 vào 2 đĩa thạch máu và thạch sôcôla đã được chia làm 6 phần tương ứng (từ 6 đến 1). Chú ý: Không cần phải đốt lại ăng khi cấy chuyển từ hỗn dịch này sang hỗn dịch khác nếu cấy từ ống số 6 đến ống số 1.

Sơ đồ cấy đếm dịch tỵ hầu

3. Điều kiện ủ ẩm

• Nhiệt độ: 35 – 37°c.
• Khí trường: 5-7% C0₂.
• Thời gian: 16-18 giờ.

4. Định danh vi khuẩn

4.1. Nhận định hình thái khuẩn lạc của từng loại vi khuẩn trên các loại môi trường

• Hình dạng.
• Kích thước.
• Màu sắc.
• Độ bóng, khô, mỡ.
• Bờ đều hay không đều.
• Tan máu.
• Mùi

4.2. Nhuộm Gram để xác định hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi khuẩn

4.3. Xác định các tính chất hóa sinh của vi khuẩn bằng các giá đường ngắn, máy định danh vi khuẩn tự động hoặc bộ API 20

5. Đọc kết quả

5.1. Đếm số lượng khuẩn lạc

• Vùng 6 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁹
• Vùng 5 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁸
• Yùng 4 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁷
• Vùng 3 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁶
• Vùng 2 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁵
• Vùng 1 có độ pha loãng cuối cùng là 10⁴

5.2. Tính toán số lượng khuẩn lạc

• Vùng 6: Số lượng khuẩn lạc X 10⁷ X 10² = SLKL X 10⁹ CPU/ ml
• Vùng 5: Số lượng khuẩn lạc X 10⁶ X 10² = SLKL X 10⁸ CPU/ ml
• Vùng 4: Số lượng khuẩn lạc X 10⁵ X 10² = SLKL X 10⁷ CPU/ ml
• Vùng 3: Số lượng khuẩn lạc X Ι0⁴ X 10² = SLKL X 10⁶ CPU/ ml
• Vùng 2: Số lượng khuẩn lạc X ΙΟ³ X 10² = SLKL X 10⁵ CPU/ ml
• Vùng 1: Số lượng khuẩn lạc X IQ² X 10² = SLKL X 10⁴ CPU/ ml

6. Nhận định kết quả

6.1. Các vi khuẩn cư trú thông thường

• Neisseria
• Corynebacterium
• Trực khuẩn Gram (-)
• Candida
• Liên cầu tan máu beta
• Micrococci

6.2. Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp

• Moraxelia catarralis
• H. influenzae
• S. aureus
• S. pneumoniae
• P. aeruginosa
• K. pneumoniae
• B. pseudomallei
• Corynebacterium
• Bordetella partussis
• Legionella