Mục tiêu
- Thực hiện được các bước của kỹ thuật cẩy phân tìm vi khuẩn gây bệnh.
- Lựa chọn đúng loại môi trường cấy phân theo chỉ định của bác sĩ.
- Định hướng đúng các loại khuẩn lạc phát triển trên các môi trường cấy phân.
- Kể được tên các loại vi sinh vật thường gây bệnh ở đường tiêu hoá.
1. Quan sát đại thể
Nhận định tính chất phân: màu sắc, lỏng, rắn, nhày máu, ký sinh trùng.
2. Soi tươi
Chỉ thực hiện khi quan sát hiện tượng di động của phảy khuẩn tả hoặc để phát hiện các loại ký sinh trùng, nấm.
3. Nhuộm soi trực tiếp
- Nhuộm xanh methylen: quan sát bạch cầu đa nhân, hồng cầu.
- Nhuộm Gram: phát hiện các vi khuẩn có hình thể đặc biệt như phảy khuẩn tả, Campylobacter, tụ cầu, nấm men, các vi khuẩn kỵ khí…
4.Chọn môi trường nuôi cấy và điều kiện ủ ấm
Dựa vào chẩn đoán lâm sàng đế biết hướng vi khuẩn cần phân lập là loại gì. Dựa vào kết quả nhuộm xanh methylen, nhuộm Gram để chọn các loại môi trường cấy phân thích hợp.
4.1. Cấy tìm Salmonella, Shigella, E. Coli, Yersinia
- Môi trường
+ Canh thang Selenite: Là môi trường tăng sinh cho các trực khuẩn đường ruột đặc biệt là Samonella. Cấy chuyển canh thang sang môi trường chọn lọc như DCA sau khi ủ ấm qua đêm.
+ Mac Conkey
+ DCA hoặc SS, DCLS, EMB, Hektoen, XLD…
- Điều kiện ủ ấm
+ Nhiệt độ: 35 – 37°c.
+ Khí trường: Bình thường.
+ Thời gian: 16 – 18 giờ.
4.2. Cấy tìm các loại Vibrio, Aeromonas
- Môi trường:
+ Pepton kiềm: sau khi ủ ấm 6 giờ, cấy chuyển lần 2 sang thạch kiềm và TCBS.
+ Thạch kiềm.
+ TCBS.
- Điều kiện ủ ấm:
+ Nhiệt độ: 35 – 37°c.
+ Khí trường: Bình thường.
+ Thời gian: 16-18 giờ.
4.3. S. aureus
- Môi trường:
+ Chapmann: Khi soi trực tiếp có hình ảnh cầu khuẩn Gram dương xếp đám.
- Điều kiện ủ ấm:
+ Nhiệt độ: 35 – 37°c
+ Khí trường: bình thường
+ Thời gian: 16 – 18 giờ
4.4. Căn nguyên gây ngộ độc thức ăn
- Môi trường:
+ Canh thang Selenit.
+ Mac Conkey.
+ DCA, SS, EMB, Hektoen, XLD…
+ Pepton kiềm.
+ Thạch kiềm.
+ TCBS.
+ Chapmann
- Điều kiện ủ ấm:
+ Nhiệt độ: 35 – 37°c.
+ Khí trường: Bình thường.
+ Thời gian: 16 – 18 giờ.
4.5. Campylobacter
- Môi trường:
+ Campylobacter agar: thạch máu Colombia 10% cho thêm 5 loại kháng sinh để ức chế các vi khuẩn khác.
- Điều kiện ủ ấm:
+ Nhiệt độ: 42°c.
+ Khí trường: 10% C02.
+ Thời gian: 18 – 48 giờ.
4.6. Các vi khuẩn kỵ khí
- Môi trường:
+ Anaerobic agar.
- Điều kiện ủ ấm:
+ Nhiệt độ: 35 – 37°c.
+ Khí trường: kỵ khí.
+ Thời gian: 48 – 72 giờ.
5. Định danh vi khuẩn
5.1.Nhận định hình thái khuẩn lạc của từng loại vi khuẩn trên các loại môi trường
Mac Conkey
- E. coli : khuẩn lạc đỏ, lactose (+).
- Klebsiella, Enterobacter: khuẩn lạc hồng, lactose (+) chậm.
- Citrobacter, Serratia, Hafnia, Provindencia: khuẩn lạc hồng nhạt sau 24 – 48 giờ, lactose (+) yếu.
- Salmonella, Shigella, Proteus, Edwardsiella: khuẩn lạc trong hoặc hơi giống màu môi trường, lactose (-).
DCA (Desoxycholate-Citrate-Agar), SS (Salmonella-Shigella)
- E. coli: khuẩn lạc đỏ đậm.
- Klebsiella, Enterobacter: khuẩn lạc hồng nhạt.
- Salmonella: khuẩn lạc không màu loại có núm đen.
- Shigella: khuẩn lạc không màu.
- Pseudomonas: khuẩn lạc không màu hoặc nâu, bờ không đều .
- Các vi khuẩn Gram (+): Bị ức chế nên không mọc hoặc mọc rất yếu
5.2. Nhuộm Gram để xác định hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi khuẩn
5.3. Xác định các tính chất hóa sinh của vi khuẩn bằng các giá đường ngắn, máy định danh vi khuẩn tự động hoặc bộ API 20.
5.4 Ngưng kết với các kháng huyết thanh đa gía, đơn giá đổi với E. Coli (EPEC), Salmonella, Shigella, Vibrio choleraeο
6. Đọc kết quả
- Dương tính: nuôi cấy phát hiện và định danh được vi khuẩn, nấm gây bệnh.
- Âm tính: không mọc vi khuẩn gây bệnh sau 48 giờ.
7. Nhận định kết quả
7.1. Các vi khuẩn cư trú thông thường ở đại tràng
- Enterobacteriaceae
- Enterococci
- Lactbacillus
- Pseudomonas spp
- Staphylococci coagulase (-)
- Các vi khuẩn kỵ khí
- Nấm men
7.2. Các sinh vật gây bệnh ở đường tiêu hóa
7.2.1. Vi khuẩn
Phần trên (dạ dày và hành tá tràng).
- Helicobacter pylori.
Phần dưới ( đại tràng)
- Salmonella
- Shigella
- Escherichia coli (EPEC, ETEC, EIEC, VTEC).
- Vibrio cholerae
- Vibrio parahaemolyticus và các Vibrio khác.
- Aeromonas hydrophilia, A. Sobria.
- Yersinia enterocolitica.
- Campylobacter
- Staphylococcus aureus.
- Bacillus cereus.
- Clostridium perfringens, c. Difficile (Vi khuẩn kỵ khí)
- Listeria
7.2.2. Virus
- Hepatitis A.
- Hepatitis E.
- Rotavirus
- Poliovirus
- Nhóm virus Norwalk.
7.2.3. Ký sinh trùng
Đơn bào
- Entamoeba histolytica.
- Giardia lamblia.
- Trichomonas
- Crytosporidium
- Cyclospora
Giun – Sán
8. Lưu ý
- Nên dựa vào chẩn đoán lâm sàng để định hướng loại vi khuẩn, nấm gây bệnh cần phân lập.
- Nên dựa vào kết quả nhuộm xanh methylen, nhuộm Gram để chọn các loại môi trường nuôi cấy, phân lập thích hợp.